Diverzita mikroflóry typickej stredoeurópskej odrody viniča – Frankovky modrej

ÚVOD

Frankovka modrá je jednou z najčastejšie pestovaných odrôd viniča v stredoeurópskom regióne. Vďaka geografickej polohe má špecifické organoleptické vlastnosti, čo jej zaručuje dôležitú pozíciu na trhu (Kružlicová a kol., 2006). Kvasinková a bakteriálna mikroflóra, ktorá je zodpovedná za  priebeh fermentačného procesu, má v produkcii vína svoje významné miesto. Prítomnosť alebo absencia niektorých druhov mikroorganizmov ovplyvňuje kvalitatívne parametre výsledného produktu. Identifikácii kvasiniek v procese výroby vína sa venovalo mnoho výskumných štúdií, do tohto výskumu sa zapojili aj dve pracoviská v Slovenskej republike (Brežná a kol., 2010). Známym faktom je, že nielen kvasinky, ale aj baktérie pôsobiace v procese výroby, značne vplývajú na kvalitu vína. Spomenuté výskumné pracoviská sa preto ako jedny z prvých zapojili aj do výskumu v oblasti bakteriálnej diverzity v produkcii vína. Rôzne bakteriálne druhy, ako napríklad baktérie octového kvasenia, môžu byť príčinou vážnych nedostatkov (Mateo a kol., 2014). Iné, napríklad baktérie mliečneho kvasenia (Oenococcus oeni), sú významné v procese jablčno-mliečnej fermentácie (Du Toit a kol., 2011). Výskum bakteriálnej mikroflóry vo víne bol v zahraničí uskutočnený napríklad na odrodách Tempranillo, Merlot, Cabernet Sauvignon a Chardonay.

Táto práca je zameraná na sledovanie diverzity bakteriálnej mikroflóry na odrode Frankovka modrá, a to v rôznych fázach fermentačného procesu. Sledovala sa bakteriálna mikroflóra na hroznových bobuliach a  v  troch fázach kvasenia. Na identifikáciu baktérií sa použil postup kultivačnej analýzy. Ako doplnková sa použila metodika nekultivačnej analýzy. Nekultivačná, teda molekulárno-biologická, analýza umožňuje detekciu baktérií, ktoré nie sú kultivovateľné štandardnými mikrobiologickými metódami, a tým je možné rozšíriť poznatky o bakteriálnej diverzite.

MATERIÁL A METÓDY VZORKOVANIE A IZOLÁCIA BAKTÉRIÍ

Vzorky hrozna odrody Frankovka modrá boli získané z Malokarpatskej vinohradníckej oblasti, z Modry, v zbere roku 2013. Vzorky 20 hroznových bobúľ sa inkubovali vo fyziologickom roztoku pri laboratórnej teplote cez noc, pri sústavnom miešaní.

Vzorky muštu sa spracovali bežným postupom (podľa Pavloušek, 2006) s niektorými modifikáciami. Vzorka hrozna bola ručne lisovaná priamo v sterilných vreckách, s použitím sterilných rukavíc. Mušt sa asepticky preniesol do sterilnej fľaše, ktorá bola uzavretá sterilnou zátkou s hydrofóbnymi vlastnosťami, aby sa zabránilo externej alebo krížovej kontaminácii. Fermentácia muštu prebiehala spontánne pri laboratórnej teplote. Vzorky muštu sa odoberali v rôznych časoch fermentačného procesu: mušt z iniciačnej fázy (označenie M1), mušt po 7–10 dňoch fermentácie (stredná fáza – označenie vzoriek M2) a mušt z konečnej fázy fermentácie (označenie M3). Pripravili sa desiatkové riedenia vzoriek a očkovali sa na kultivačné médiá: R2A, GYC (na kultiváciu baktérií octového kvasenia za aeróbnych podmienok; médium obsahuje glukózu, kvasničný extrakt, uhličitan vápenatý a agar), de Man-Rogosa-Sharpe agar (MRS agar na kultiváciu kyslomliečnych baktérií za anaeróbnych podmienok), MRS-Tomato (MRS-T; MRS médium suplementované 10 % paradajkovou šťavou na anaeróbnu kultiváciu kmeňov Oenococcus). Každé agarové médium bolo suplementované cykloheximidom, ktorý inhibuje rast kvasiniek. Platne sa inkubovali pri 30 °C počas 3 až 10 dní. Náhodne boli odoberané kolónie v počte 30 z každého štádia a prenesené na novú agarovú platňu.

SELEKCIA A IDENTIFIKÁCIA BAKTERIÁLNYCH IZOLÁTOV

Baktérie, ktoré vyrástli na agarových médiách R2A, GYC, MRS alebo MRS-T sa suspendovali vo fyziologickom roztoku a centrifugovali sa. Sediment sa resuspendoval v sterilnej vode a opäť sa centrifugoval. K sedimentu sa pridala matrica InstaGene Matrix. Po inkubácii sa zmes miešala na miešadle typu vortex a inkubovala sa pri vyššej teplote. Po opätovnom premiešaní a centrifugácii bol supernatant použitý na PCR analýzu. 

Izolované kmene boli klastrované fluorescenčnou ITS-PCR (f-ITS). Interný transkribovaný medzerník medzi génmi 16S a 23S rRNA sa amplifi koval a fluorescenčne značené PCR produkty sa separovali kapilárnou elektroforézou (Pangallo a kol., 2013). Tento druh PCR sa používa na odlíšenie ITS oblastí na základe počtu kópií a polymorfizmu dĺžky fragmentov v  bakteriálnom genóme rôznych bakteriálnych druhov. Amplifikáciou ITS (internal transcribed spacer – interný transkribovaný medzerník) oblastí sa získajú druhovo špecifické profily, na základe ktorých je možné klastrovanie analyzovaných kmeňov. 

PCR zmesi obsahovali primery G17 (fluorescenčne značený) a L1. Ďalšími zložkami zmesi boli typické reagencie potrebné na úspešnú PCR (tlmivý roztok, zmes dinukleotidových báz, DNA-polymeráza). Získané ITS-PCR produkty sa separovali na automatickom genetickom analyzéri. Veľkosť DNA fragmentov sa určovala s použitím Liz-600 DNA štandardu a softvéru GeneMapper 3.7 (Applied Biosystems). 

Z  každého klastra sa vybrali reprezentatívne kmene a identifikovali sa sekvenovaním 16S rRNA génov s použitím primerov 27F a 685R. Použil sa identický program pre PCR ako v prípade f-ITS PCR. Produkty pred sekvenovaním sa purifikovali metódou ExoSAP-IT. Na sekvenovanie sa použil komerčný sekvenátor. Získané sekvencie sa porovnali s databázou GenBank pomocou vyhľadávania v systéme BLAST.

EKULTIVAČNÁ ANALÝZA

Vzorky (bobule, mušt vo fáze M1, M2 a M3) zo sledovanej odrody Frankovka modrá sa premyli v roztoku TE. Následne sa odstránil supernatant a pridal sa lyzozým, RN-ázaA a sklenené guľôčky (≤106 ěm). Zmes sa miešala na miešadle typu vortex, inkubovala pri 37 °C počas 60 min a nechala sa zmraziť pri -20 °C na dobu minimálne 1 hodiny. Po roztopení sa pridala proteináza K a tlmivý roztok AL z komerčnej súpravy DNeasy Blood and Tissue kit. Po kultivácii a centrifugácii sa tekutá zložka preniesla do novej mikroskúmavky. Tento krok slúžil na sedimentáciu sklenených guľôčok. V ďalšom kroku sa pridal etanol a pokračovalo sa podľa návodu výrobcu súpravy prenesením zmesi na minikolónku, premývaním a elúciou produktu.

Bakteriálne gény 16S rRNA sa analyzovali v dvoch amplifikačných  krokoch. V prvom kroku sa použili primery 341f a 985r. Špecificita amplifikácie sa zisťovala elektroforeticky.

DGGE analýza (denaturing gradient gel electrophoresis – elektroforéza v denaturačnom gradiente) sa uskutočnila použitím tzv. semi-nested PCR. PCR produkt prvej reakcie sa použil ako templát pre druhú PCR. 16SrDNA sa reamplifi kovala s primermi 341f-GC a 518r. Produkty semi-nested PCR sa overovali elektroforézou na agarózovom géli. Produkty sa potom precipitovali etanolom a resuspendovali vo vode. Takto pripravené vzorky sa analyzovali na DGGE s denaturačným gradientom 25 % – 55 %. 

Časť produktu z prvej amplifikácie sa použila na zostavenie bakteriálnej 16S rDNA knižnice klonov. PCR produkty boli purifikované súpravou QIAquick PCR purification kit a  ligované do pGEM-T Easy vektora. Potom boli transformované do E. coli XLI-Blue a vysiate na platne s LB médiom s prídavkom ampicilínu a IPTG. Okolo 60 bielych klónií z každej knižnice (bobule, M1, M2, M3) sa overovalo špecifickou PCR s primermi SP6 a T7. Pozitívne klony z každej knižnice sa analyzovali metódou DGGE s použitím primerov 341f-GC a 518r. Profily jednotlivých klonov sa porovnávali navzájom, aj v rámci komunity. Klony s odlišnými profilmi sa sekvenovali s použitím primerov SP6 a T7. Získané sekvencie sa porovnávali s databázou GenBank s použitím vyhľadávača BLAST.

VÝSLEDKY

Výskum bakteriálnej mikroflóry sa orientoval na niekoľko štádií výroby vína: bobule, mušt z iniciačnej fázy (označenie M1), mušt po 7–10 dňoch fermentácie (stredná fáza – označenie vzoriek M2) a mušt z konečnej fázy fermentácie (označenie M3). Bol vyvinutý postup odoberania, uskladnenia a  kultivácie vzoriek vo vhodných kultivačných médiách. Vzorky DNA na ďalšiu analýzu sa získali metódou s použitím InstaGene matrix, ktorá zabezpečuje rýchlu, jednoduchú a finančne úspornú metódu prípravy templátovej DNA na následnú PCR analýzu. Táto metóda je zvlášť účinná pri odstraňovaní možných inhibítorov PCR.

Izolované kmene baktérií sa analyzovali použitím PCR s fluorescenčne značeným primerom, pričom cieľovou oblasťou bola medzerníková oblasť medzi génmi 16S a 23S rRNA. Porovnávanie ITS oblastí sa využíva v taxonómii z dôvodu jednoduchej amplifikácie aj nízkych koncentrácií DNA a vysokého stupňa variability aj u príbuzných druhov.

Na základe výsledkov získaných z porovnania profi lov na kapilárnej elektroforéze sa vybrali kmene, ktoré boli potom sekvenačne overené a zaradené na základe porovnania s databázou známych bakteriálnych druhov. Výsledky tejto časti analýzy uvádzame v tabuľke 1. 

[Show slideshow]

Pri kultivačnom postupe na hroznových bobuliach boli zastúpené čeľade Acetobacteraceae (Acetobacter spp., Gluconobacter spp.), Bacillaceae (Bacillus spp.), Enterobacteriaceae (Enterobacter sp.), Lactobacillaceae (Lactobacillus plantarum), Micrococcaceae (Micrococcus flavus), Pseudomonadaceae (Pseudomonas sp.), Leuconostocaceae (Leuconostoc mesenteroides), Staphylococcaceae (Staphylococcus sp.). 

Podobné zastúpenie bolo aj v mušte M1: Acetobacteraceae (Acetobacter cibinongensis), Bacillaceae (Bacillus sp.), Leuconostocaceae (Leuconostoc spp.), Staphylococcaceae (Staphylococcus sp.). Značné zastúpenie mala čeľaď Lactobacillaceae (Lactobacillus spp.). Zaznamenala sa aj prítomnosť baktérie octového kvasenia Asaia lannaensis a baktérie mliečneho kvasenia z čeľade Fructobacillus (Fructobacillus fructosus). 

V mušte M2 sa opäť vyskytovali zástupcovia z čeľadí Acetobacteraceae, Lactobacillaceae, Leuconostocaceae a Staphylococcaceae a na rozdiel od muštu M1, ale zhodne s bobuľami, aj kmene z čeľade Bacillaceae.

 V mušte M3 sa kultivačnou metódou podarilo identifi kovať iba Lactobacillaceae a Oenococcus oeni (tabuľka 1).

Metódou DGGE pri odrode Frankovka modrá sme na povrchu bobúľ detegovali baktérie z čeľadí Acetobacteriaceae (Gluconobacter spp.) a Enterobacteriaceae (93 % zastúpenie z  celkových analyzovaných klonov (Tatumella spp., Pantoea spp., Erwinia spp.)). Diverzita v prípade muštu bola rôznorodejšia, boli zaznamenané čeľade: Pseudomonadaceae, Propionibacteriaceae, Comamonadaceae (Curvibacter gracilis), Pseudonocardiaceae (Amycolatopsis spp.), Micrococcaceae (Kocuria kristinae), Moraxellaceae (Acinetobacter johnsonii, Moraxella osloensis), Enterobacteriaceae (Kluyvera intermedia) a aj Cyanobacteria (Cylindrospermum stagnale). Sinice sa vyskytovali aj v mušte z fázy M2 až v 70 % zastúpení, vo vzorkách označených M3 ich záchytnosť klesla na 2 % (Geitlerinema sp., Gloeocapsa sp.). Čelaď Enterobacteriaceae sme dokázali zachytiť aj v M2 a v M3. V M2 sa ďalej vyskytoval Agrobacterium vitis a Microterricola viridarii. Oveľa rôznorodejšia mikrofl óra bola v M3, kde sme dokázali zachytiť čeľade: Enterobacteriaceae (Enterobacter sp., Pantoea spp., Providencia sp.), Micrococcaceae (Arthrobacter spp., Micrococcus sp.), Moraxellaceae (Acinetobacter spp.), Propionibacteriaceae, Microbacteriaceae (Curtobacterium sp.), Hydrogenophilaceae (Hydrogenophilus thermoluteolus) a Aeromonadaceae (Aeromonas sharmana). Z výsledkov vyplýva, že najvyššia diverzita bola v M1 a v M3. V ostatných vzorkách (bobule, M2) mohli byť baktérie potlačené prevažujúcimi kvasinkami (tabuľka 2).

Príklad výstupu z detekcie hroznových bobúľ z odrody Frankovka modrá metódou DGGE je na obrázku. 

Z výsledkov je vyplýva, že kombináciou kultivačných a nekultivačných metód sa podarilo identifi kovať celý komplex bakteriálnych spoločenstiev, ktoré pozostávali zo sporadicky sa vyskytujúcich druhov, ale tiež z mikroorganizmov, ktoré sa pravidelne podieľajú na fermentačnom procese pri výrobe vína. Vo výskumných prácach sa v minulosti kládol dôraz na baktérie octového a mliečneho kvasenia. V tejto práci sa prezentuje prítomnosť niektorých baktérií (Amycolatopsis a Hydrogenophilus) vôbec po prvýkrát. Potvrdila sa prítomnosť niektorých baktérií (Variovorax, Pantoea, Enterobacter a Tatumella), ktoré doteraz neboli podrobnejšie preskúmané z hľadiska ich enzymatického pôsobenia v procese výroby vína. Štúdium vlastností baktérií môže byť novou perspektívou na poli výskumu v oblasti vinárstva. 

Ľubica Piknová ¹ , Domenico Pangallo², Katarína Ženišová ¹ , Andrea Puškárová ², Mária Bučková ²,Lucia Kraková ^{2, 1} Národné poľnohospodárske a potravinárske centrum – Výskumný ústav potravinársky, Bratislava, ² Ústav molekulárnej biológie SAV, Bratislava

Ilustračné foto archív redakcie

REFERENCIE 

Kružlicová D., Ďurčeková, T., Kraic, F., Mocák, J., Hrivňák, J., Pátková, J. (2006) Chemometrická charakterizácia, klasifi kácia a autentifikácia slovenských odrodových vín. Nova Biotechnologica 6, 29-36.
Mateo, E., Torija, M. J. , Mas, A., Bartowsky, E. J. (2014) Acetic acid bacteria isolated from grapes of South Australian vineyards. International Journal of Food Microbiology 178, 98-106.
Du Toit, M., Engelbrecht, L., Lerm, E., Krieger-Weber, S. (2011) Lactobacillus: The Next Generation of Malolactic Fermentation Starter Cultures-an Overview (Review). Food and Bioprocess Technology 4 (6), 876-906.
Pavloušek, P., (2006). Výroba vína u malovinařu. Grada, Praha.
Brežná, B., Ženišová, K., Chovanová, K., Chebeňová, V., Kraková, L., Kuchta, T., & Pangallo, D. (2010). Evaluation of fungal and yeast diversity in Slovakian wine-related microbial communities. Antonie Van Leeuwenhoek,98(4), 519-529.
Pangallo, D., Kraková, L., Chovanová, K., Bučková, M., Puškarová, A., & Šimonovičová, A. (2013). Disclosing a crypt: microbial diversity and degradation activity of the microfl ora isolated from funeral clothes of Cardinal Peter Pázmány. Microbiological research, 168(5), 289-299.

Tags: 01/2016